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　　ELISA實(shí)驗(yàn)—試劑盒實(shí)驗(yàn)基本知識(shí)點(diǎn)

　　基本類型:

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (以下簡(jiǎn)稱ELISA) ：是酶免疫測(cè)定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 ) 表面，使酶標(biāo)記的抗原-抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測(cè)大分子抗原，后者用于測(cè)定特異抗體。

　　用途:

　　根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點(diǎn)ELISA(Dot-ELISA);再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中，又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

　　操作程序:

　　1、間接ELISA

　　本法主要用于檢測(cè)抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：

　　(1) 材料

　　① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;

　　② DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽(yáng)性DVH參考血清;待檢鴨血清;

　　③ ELISA檢測(cè)儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

　　(2) 方法步驟

　　① 加抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　　② 加待檢血清 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

　　③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干

　　④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液

　　⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值，并計(jì)算出P/N比值。

　　(3) 結(jié)果判定 已知陽(yáng)性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1，而且已知陽(yáng)性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽(yáng)性，否則判為陰性。

　　2、雙抗體夾心ELISA

　　本法主要用于檢測(cè)大分子抗原。現(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。

　　① 加抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　　② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　　③ 加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　　④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液

　　⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

　　3、雙夾心ELISA

　　此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于：它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標(biāo)記每一種抗體，還可提高試驗(yàn)的敏感性。

　　此法的基本程序?yàn)椋?/p>

　　① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　　② 加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　③ 加用非同種動(dòng)物生產(chǎn)的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　④ 加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　　⑥ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

　　4、競(jìng)爭(zhēng)ELISA

　　此法主要用于測(cè)定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測(cè)定。

　　其基本程序?yàn)椋?/p>

　　① 抗體包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　　② 加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原(對(duì)照孔僅加酶標(biāo)抗原)→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　　④ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

　　被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè);其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記，而且因?yàn)榭乖慕Y(jié)構(gòu)不同，還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外，試驗(yàn)中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。

　　5、阻斷ELISA

　　本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬病(PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測(cè)方法。

　　下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測(cè)法為例介紹其操作程序：

　　① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過(guò)夜，洗滌三次、拋干

　　② 用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干

　　⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干

　　⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液

　　⑦ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

　　本試驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照、兔抗AP2型陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照。

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